细胞冻存是一种在低温条件下保存细胞的技术，目的是保持细胞在长期存储中依然具备活性和功能。这一过程对于细胞系的长期维护、实验的可重复性、基因库的构建以及细胞治疗的备份具有重要意义。通过冻存，可以有效降低细胞在传代过程中出现的遗传变异，避免因污染、环境变化或实验操作失误而造成的细胞损失。选择在细胞处于最佳生长速率时进行冻存，可以有效提升冻存成功率。

冷冻保护剂是细胞冻存的关键成分，其常见类型包括二甲基亚砜（DMSO）和甘油。冷冻保护剂的主要功能是降低溶液的冰点，减少冰晶的形成，从而防止细胞受到冰晶引起的物理损伤。尽管DMSO广泛应用于不同细胞类型的冻存中，但部分细胞对其存在敏感性，此时甘油则可以作为有效替代。

第1阶段：冷冻保存实验步骤

1. 在冷冻管上清晰地标记日期、研究人员姓名、细胞编号、传代数及细胞类型等相关信息。

2. 如果操作的是贴壁细胞，首先去除细胞培养基，并用PBS清洗。然后加入适量的胰蛋白酶，覆盖细胞，并在37°C培养箱中孵育约2分钟（具体时间根据细胞类型调整）。

一旦消化作用终止，添加等量的培养基，用移液枪轻轻吹打细胞，随后将贴壁细胞转移至50 mL Falcon管中。

3. 对于悬浮培养的细胞，直接将所需体积的细胞转移至50 mL Falcon管中。

4. 使用血细胞计数器计数细胞以确认活力，冷冻保存的细胞活力应至少为75%。

5. 室温下以300× g离心5分钟。

6. 准备适合的冷冻培养基（见表1）。

表1：不同哺乳动物细胞系适用的冻存培养基配方

细胞类型 | 冻存培养基配方

在含有FBS的培养基中培养的细胞 | 90%胎牛血清 + 10%二甲基亚砜

在无血清培养基中培养的细胞 | 90%条件培养基 + 10%二甲基亚砜

需要甘油冷冻的细胞 | 90%胎牛血清 + 10%甘油

使用前将培养基充分混合并加热至37°C。注意，DMSO并不适合所有细胞类型，必要时可用甘油替代。

7. 脱去上清液。

8. 加入冻存培养基至所需细胞密度，通常为1×10⁶/mL，细胞在冻存液中室温下放置的时间不应超过10分钟。

9. 将1 mL样品分装至冷冻管中，并紧盖。

10. 将冷冻管转移至室温冷冻盒中，再放入-80°C的冰箱。确保冷冻盒外侧添加适量的异丙醇，以使温度以每分钟1°C的速度逐渐下降。

缓慢的冷冻过程有助于防止细胞内冰晶的形成。

11. 约24小时后，将冷冻管从冷冻盒中取出并转移至液氮中长期保存。通常情况下，冻存细胞可在液氮中保存数年，而不应长时间储存于-80°C，以免影响细胞活力。

第2阶段：解冻冷冻细胞系实验步骤

1. 从液氮储存器中取出冷冻管，快速放入37°C水浴中，直至约80%解冻（切勿在室温下解冻）。此过程应控制在1分钟之内。

因为缓慢解冻会对细胞造成损伤，细胞需尽快解冻。此外，DMSO具有一定的细胞毒性，因此快速解冻有助于稀释DMSO。

2. 使用移液器将冷冻管中的物质转移至含有约10 mL预热培养基的15 mL Falcon管中。

3. 以300× g离心5分钟，弃上清液，用适量培养基重悬细胞沉淀。

4. 将细胞悬液转移至培养容器，并放入37°C的培养箱中培养。

通过以上步骤，使用PG电子提供的方法，您可以安全有效地进行细胞冻存和解冻，从而保证实验的可靠性与细胞活力。